不過說歸說，我想很多人還是保持觀望心態，不想成為第一人去嘗試新的做法。其實我也可以理解，同時我也知道，如果想要提供替代方案，最好的做法就是做到徹底的無縫接軌，讓大家轉換超順利，最好還有額外的好處跟誘因，才可能促成改變。
所以，如果要說使用丁香油或苯氧基乙醇作為牛蛙安樂死的藥劑，我最好也是自己做過，才知道那是怎麼一回事。
於是，我就真的去買了丁香油跟苯氧基乙醇，然後獲得了授課老師的同意，這幾個月來就在原本就會使用到牛蛙的實驗課單元中測試兩者的效果。
由於本文很長，因此先寫結論：
丁香油和苯氧基乙醇這兩種藥品都是肌肉神經阻斷劑，所以將牛蛙麻醉致死的過程中，中樞神經還沒有失去活性之前就會發生呼吸衰竭，讓牛蛙遭受不能呼吸的窒息痛苦，這也是為什麼過量麻醉致死的過程中牛蛙會有一陣子劇烈的掙扎。
因此，不建議以丁香油或苯氧基乙醇來過量麻醉犧牲牛蛙，因為這並不是安樂死。
雖然，這兩種藥物比起乙醚是對人超級安全，又不會對牛蛙皮膚有太大刺激，但這個世界並不是只有「只能使用乙醚」和「只能使用丁香油或苯氧基乙醇」這兩條「都不是安樂死」的路。既然要改變，那就改變得徹底一點，真正做到人道安樂死才是王道。如果沒有辦法執行安樂死，那就不應該犧牲動物來做實驗。沒有那個屁股，就不要吃那個瀉藥。
所以，這兩種藥物的正確使用方法，是以適當濃度來麻醉牛蛙然後執行穿刺，這才是符合安樂死規範的做法。而且，被麻醉的牛蛙一點都不會掙扎，非常容易穿刺，又因為麻醉了所以就算慢慢做穿刺也不會造成痛苦，大可以放心練習操作。
如果真的無法執行穿刺，那麼另一個退而求其次的方法，是使用這兩種藥物適度麻醉牛蛙之後，再將牛蛙冷凍致死。這個做法理論上應該也足夠人道，因為安樂死規範中有提到，在人員安全考量的前提下，兩生爬行類在深度麻醉之後是可以冷凍安樂死的。因此，用這兩種藥物把牛蛙麻醉之後，再放進冷凍庫凍成冰棒，應該也是個雖不能完全保證毫無痛苦但應該足夠人道的做法。
這幾次的測試中，都是使用原本上課就會犧牲的牛蛙，因此並沒有額外犧牲牛蛙來測試麻醉劑的問題。
第一次測試
測試的目的有三：一是了解這兩種麻醉劑的功效，看看需要多久才能讓牛蛙麻醉致死。
二是了解牛蛙在麻醉過程中的反應，有沒有什麼掙扎反抗，或是身體上有出現什麼刺激的跡象。
三是進一步了解，畢竟這兩種都是麻醉劑，如果麻死之後拿來穿刺，還會不會有穿刺正確時可見的跡象（手臂抽動＆後腿伸直等）。
我們把12隻牛蛙分成兩群，丁香油和苯氧基乙醇各用了6隻。以15分鐘當作一個階段，每次拿出兩隻牛蛙來觀察麻醉狀況，其中一隻拿來穿刺以確認這個麻醉程度的牛蛙還會不會有穿刺正確時的肢體抽動現象，另一隻則放著觀察會不會過了一段時間就退麻醉甦醒。所以，在麻醉程度上我們就有15分鐘、30分鐘以及45分鐘三個程度，而且各自有一隻穿刺的牛蛙來看這個麻醉程度的穿刺反應，也各自有一隻牛蛙可以觀察這樣的麻醉程度，是否會在一段時間之後退麻甦醒。
兩種麻醉劑使用的濃度分別如下：我們在5L的水中加入3ml的丁香油，也就是0.6ml/L的濃度，比起過去的文獻建議的是高了點（通常建議是0.35ml/L左右的濃度，最高的建議濃度也不過是0.45ml/L的濃度），至於這樣是不是太過了，我們可以先看看後面的結果再來討論。而苯氧基乙醇的濃度則是依照建議，在5L水中加入50ml的苯氧基乙醇，配成1%的濃度。就這樣兩桶水，各放進6隻牛蛙，在牠們每一隻都可以踩得到底的深度和空間中，開始測試兩種麻醉藥的效果。
麻醉至死的過程分別描述如下：
牛蛙一放入丁香油溶液中毫無掙扎或反應，就是扶著桶壁站在水裡，一切如常。但是過了5分鐘之後開始向上劇烈彈跳，這時候千萬要把蓋子蓋好蓋緊以免牛蛙跳出來，掙扎一分多鐘之後就又恢復平靜，之後不再有任何動作。
至於苯氧基乙醇溶液，牛蛙是一放進去之後一分鐘內就開始彈跳想逃，但是也是過了一分多鐘就不再有反應。
接下來，我們每15分鐘各拿出兩隻牛蛙，將其中一隻穿刺來確認麻醉後的牛蛙會不會有任何穿刺的動作反應。我們發現，無論是丁香油或是苯氧基乙醇，以本次的濃度僅僅是麻醉15分鐘，牛蛙在被穿刺時就已經幾乎沒有任何動作反應。仔細比較的話，丁香油麻醉的牛蛙在探針刮過延腦和上段脊髓時會有一點點的上肢抽動，探針向下穿刺脊髓時稍微有一點點伸腿動作，而苯氧基乙醇麻醉的牛蛙則是什麼反應都沒有。麻醉15分鐘的效果如此，麻醉30分鐘和45分鐘的牛蛙就更不用說了，就是個死掉的狀態，什麼動作都沒有。
穿刺的牛蛙反應如此，另外6隻沒有穿刺、僅僅是拿出來對照的牛蛙也是完全麻透。無論是丁香油或是苯氧基乙醇，麻醉15分鐘的牛蛙顯然就已經死亡，在之後幾小時的操作中都沒有任何的反應。
我們另外也用肌肉電極器來刺激肌肉，想要知道這樣犧牲的牛蛙能不能用在肌肉與神經相關的生理學實驗單元中，結果是丁香油麻醉15分鐘就會讓肌肉幾乎沒有任何動作，除非沖沖水再把電極器開到最強肌肉才會收縮。根據文獻，丁香油的主要成份丁香酚的麻醉作用機制在inhibition of voltage-gated sodium channel (VGSC) and activation of transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1)，所以不只是麻痺神經，也會讓肌肉都癱瘓掉。也因此有這樣的效果也是理所當然。不過，稍微查了一下文獻，苯氧基乙醇的麻醉機制似乎還是不太清楚。
另外，在解剖時也觀察到心臟跳動很弱，甚至都停止跳動。由於後來我不在，根據轉述，還有微弱跳動的應該都是丁香油致死的個體。
最後，丁香油致死的個體的牛蛙腹面幾乎沒有任何泛紅異狀，但是苯氧基乙醇致死的個體則是有些微泛紅。對照牛蛙在麻醉過程中出現劇烈彈跳掙扎反應的時間，也許暗示苯氧基乙醇對牛蛙皮膚稍有刺激性，即使只是使用建議濃度（1%）依然如此。
總結一下丁香油（0.6ml/L）和苯氧基乙醇（1%）的效力：
- 兩者都是麻醉15分鐘就能讓牛蛙死亡，就算不補穿刺也不會再甦醒。
- 麻醉過程中，牛蛙都有一分多鐘的強烈彈跳反應，差別在於丁香油麻醉的牛蛙是在麻醉五分鐘之後開始反應，苯氧基乙醇則是放下去一分鐘內就開始反應。
- 以腹部泛紅的程度作為指標，丁香油（即使使用了相當高的濃度）致死的牛蛙腹部都沒有泛紅，但苯氧基乙醇致死的牛蛙有。顯然丁香油對牛蛙的刺激性比苯氧基乙醇弱。
- 兩者麻醉15分鐘以上，牛蛙被穿刺時都幾乎不會有任何的肌肉反應。所以如果要先麻醉再穿刺，而且期望看到穿刺時牛蛙的反射動作，那麼就必須以文獻建議的濃度來麻醉才行。
後記：
坦白說，看到牛蛙掙扎跳動是有點讓我驚訝，因為一個良好的麻醉安樂死應該是讓動物就昏倒，而不會有什麼明顯的掙扎。當然，我們知道這次使用的丁香油濃度偏高，所以也許再把丁香油濃度降到0.45ml/L甚至0.35ml/L，就可以改善這個狀況。倒是，苯氧基乙醇的濃度雖然依照建議，但是後來比照一些文獻（這裡、這裡），似乎1%也是太高了。雖然文獻中麻醉的對象都是魚類，但是對於兩棲類也許也是有向下調整的空間。
有人可能會想：反正是麻醉到死，確定會死比較重要吧。但是我要強調，安樂死之所以是安樂死，就是在「讓動物在盡可能沒有痛苦的狀況下死去」。既然動物會掙扎，那就表示還有劑量調整改善的空間，或甚至是這個麻醉劑其實無法人道致死，所以並不是確定會死就算了。就算是可以用來安樂死的麻醉劑，劑量不對也可能會造成動物不舒服，這樣就不夠安樂。在還沒有辦法不讓動物額外犧牲之前，盡量做到「免除其不必要的痛苦」是最重要的任務。
至於對人的影響，丁香油和苯氧基乙醇都是非常安全的藥劑，丁香油是天然的精油成份，濃度不超過1.5ml/L對人類都不會有毒性。而且在牙科上經常拿來作為殺菌劑和麻醉劑，所以如果你使用丁香油來麻醉牛蛙，那個味道應該會讓你有似曾相識的感覺。沒錯，就是你看牙醫坐在診療椅上的時候，或是洗牙完了起身漱口的時候，會聞到的那個味道。是香是臭見仁見智，但是基本上牛蛙死亡以後拿出來沖沖水，應該就不會有什麼明顯氣味。而苯氧基乙醇也是非常常用的化妝品添加物，用來殺細菌真菌兼防腐，聞起來有非常清淡的玫瑰香（因此也叫做玫瑰醚），所以也可以放心使用。
最後關於價錢：
丁香油在台北後火車站的第x化工行是500ml一罐2600元，要是像我一樣每次用3ml泡個5L溶液來安樂死6隻牛蛙，可以用上160-250次，也就是平均每次10-16元，可以用到天荒地老。如果溶液的效力足以重複使用的話，每次的花費就更便宜了。
苯氧基乙醇我買的是試用包，100ml小罐裝200元，泡個5L的1%溶液只能用兩次，平均每次花費100元。但是如果買500ml大罐裝價錢就只要600元，平均每次花費只剩60元，可以用10次。要是溶液的效力足以重複使用，花費就更便宜；要是濃度調降（降多少要再測試），當然就更更便宜了。
第二次測試
因為苯氧基乙醇能夠查到的麻醉研究文獻太少，所以就不測試苯氧基乙醇的效果，專心的測試丁香油的效果就好。為了讓牛蛙掙扎得更少，所以把丁香油濃度調降，在5L水裡面加入2ml丁香油（也就是0.4ml/L的濃度，符合文獻建議），放了12隻牛蛙進去，結果麻醉30分鐘還是沒有死亡，碰眼睛時眨眼反射依然存在。不過，過程中牛蛙的呼吸明顯變得用力，下顎和腹腔的肌肉都更大幅度的收縮，推測是肌肉已經受到丁香油的影響，所以需要更用力收縮才能有助呼吸。為了讓牛蛙安樂死，追加了1ml丁香油進去（濃度因此達到0.6ml/L，和上次測試一樣）。很快的牛蛙就開始劇烈掙扎，而且這次掙扎的時間還稍長了一點，數分鐘後才失去活動，15分鐘後失去所有呼吸和反射活動，犧牲完成。
這次測試顯示，雖然0.6ml/L的丁香油比文獻上建議的最高值（0.45ml/L）高了不少，但是對牛蛙而言可能才是足以在15分鐘內達到麻醉至死的濃度。否則的話，減低濃度只能造成部份的麻醉。若是後續追加，反而會劇烈掙扎得更久。
所以，真的要用丁香油把牛蛙犧牲，使用0.6ml/L的濃度可能是最保險的濃度，得以在15分鐘內讓牛蛙徹底死亡。
另外，致死過程中的掙扎讓我總是覺得不對勁。以後如果有機會，希望可以使用MS222測試看看，假如這個知名的兩生類麻醉安樂死藥劑在過量導致安樂死的過程中不會讓動物掙扎，那就表示丁香油（和苯氧基乙醇）在麻醉致死的過程中會造成動物緊迫，不適合作為安樂死藥劑。
第三次測試
上一次的測試之後搜尋了好些文獻，得知丁香油應該要以1：10的比例溶於無水酒精中，因此本次測試比較了溶於酒精再配成0.4ml/L溶液和直接將丁香油加入水中配成0.4ml/L溶液的差異。而且，這次使用大的整理箱，丁香油水溶液的深度大概5公分，讓每隻牛蛙都可以自然的在底部移動，不會疊在一起，也不需要在水桶中費力的扶著牆壁站著，這樣要觀察牛蛙的行為和麻醉過程中的反應也比較自然。很明顯的，先以無水酒精為溶劑配成10%的丁香油酒精溶液，再配成水溶液，讓丁香油能夠更均勻的成霧狀散布在水中，水面也沒有大片油花。相比之下，丁香油直接加入水中會在水面有大片油花，水體中和水底也是大團的油滴聚集，麻醉效果應該會因此降低，局部的高濃度接觸對牛蛙可能也有比較強的刺激。
  |
| 以無水酒精製備10%丁香油溶液再調成0.4ml/L丁香油水溶液（左）和直接將丁香油加入水中調成0.4ml/L丁香油水溶液（右）的表面油滴差異 |
以無水酒精製備10%丁香油溶液再調成0.4ml/L丁香油水溶液（左）和直接將丁香油加入水中調成0.4ml/L丁香油水溶液（右）的油滴在水中分佈差異
而且，先製備成丁香油無水酒精溶液再調成0.4ml/L丁香油水溶液，用來麻醉8隻牛蛙的效果很好。在15分鐘的麻醉期間，牛蛙的活動正常，並沒有劇烈掙扎或跳動的跡象，但漸漸就會失去肢體控制的能力而四肢放鬆趴倒。將麻醉後的牛蛙脊椎穿刺，不僅不會有任何掙扎和反抗，更依然保有正確穿刺時的肌肉抽動和伸腿反射。因此，還是可以藉此判斷穿刺正確與否。
另外，使用肌肉電擊器刺激肌肉，也還是能夠看到肌肉收縮，所以這樣先以丁香油麻醉15分鐘再穿刺的做法，也適用於需要保留肌肉活性的實驗單元，對於需要保留神經活性的實驗單元或許也適用。
值得注意的是，上次測試之後進行文獻搜尋與回顧，綜合獸醫安樂死規範和丁香油麻醉的研究文獻，確定了丁香油是以肌肉神經阻斷的方式產生麻醉效果，因此過量麻醉致死時，在中樞神經失去活性之前會先造成呼吸衰竭。因此，這樣的肌肉神經阻斷劑都不能拿來做為安樂死的藥物。
這也就是為什麼以丁香油（還有苯氧基乙醇）麻醉牛蛙致死的過程中，牛蛙會有劇烈掙扎的現象，想必那時候就是呼吸衰竭窒息的緊迫狀態。
這樣看來，丁香油作為牛蛙的麻醉劑是很不錯，但實在不適合拿來把牛蛙麻醉致死，因為這樣真的不安樂。除非我們有辦法讓牛蛙在中樞神經失去活性之前都不要呼吸衰竭，不然丁香油實在不適合直接做為過量麻醉致死的藥物。
不過，既然丁香油可以麻醉牛蛙，讓牛蛙在被穿刺的時候毫無反應跟反抗，那麼把麻醉之後的牛蛙放進冷凍庫裡冷凍致死，或許是無法執行脊椎穿刺的人的另一個『可能還算人道』的做法。既然已經麻醉，神經就不會傳導痛覺，於是當溫度降到足以停止中樞神經系統時，牛蛙漸漸凍成冰棒應該就能夠人道致死。不過，由於牛蛙是溫帶種類，天生就有能夠熬過低溫的抗凍機制，因此，麻醉之後放進冷凍庫凍成冰棒的時間應該要足夠長（例如24小時？這可能要測試才知道），才能夠確保牛蛙必定因冷凍而死亡。